آزمایش الکتروفورز هموگلوبین

اصل آزمایش

هدف الکتروفورز هموگلوبین شناسایی و تایید انواع هموگلوبین های طبیعی و غیر طبیعی است.

با توجه به بارهای مختلف و نقاط ایزوالکتریک انواع مختلف هموگلوبین، در محلول بافر pH مشخص، زمانی که نقطه ایزوالکتریک هموگلوبین کمتر از pH محلول بافر باشد، هموگلوبین حامل بار منفی بوده و در طول الکتروفورز به سمت آند مهاجرت می کند. برعکس، هموگلوبین با بار مثبت به سمت کاتد حرکت می کند.

تحت یک ولتاژ معین و پس از یک زمان الکتروفورز خاص، هموگلوبین‌ها با بارها و وزن‌های مولکولی متفاوت جهت‌ها و سرعت‌های مهاجرت متفاوتی را نشان می‌دهند. این امکان جداسازی نواحی متمایز را فراهم می کند و می توان آنالیز اسکن رنگ سنجی یا الکتروفورتیک بعدی را روی این نواحی برای تعیین کمیت هموگلوبین های مختلف انجام داد. متداول ترین روش مورد استفاده الکتروفورز غشایی استات سلولز با pH 8.6 است.

در داخل سیتوپلاسم، گروه های اتیلن گلیکول (CHOH-CHOH) موجود در گلیکوژن یا مواد پلی ساکارید (مانند موکوپلی ساکاریدها، موکوپروتئین ها، گلیکوپروتئین ها، گلیکولیپیدها و غیره) توسط اسید پریودیک اکسید شده و به گروه های آلدهیدی (CHO-CHO) تبدیل می شوند. این گروه‌های آلدهیدی با معرف شیف بی‌رنگ قرمز مایل به ارغوانی ترکیب می‌شوند و یک رنگ قرمز بنفش را تشکیل می‌دهند که در جایی که پلی‌ساکاریدها در سلول وجود دارند، رسوب می‌کنند. این واکنش به رنگ آمیزی اسید-شیف دوره ای (PAS) معروف است که قبلاً رنگ آمیزی گلیکوژن نامیده می شد.

روش آزمایش

مواد:استات سلولزممبران، دستگاه الکتروفورز(DYCP-38C و منبع تغذیه DYY-6C), ابزار بارگیری نمونه برتر(پیپت), اسپکتروفتومتر, کووت های رنگ سنجی, بافرها

بافر:

(1) بافر pH 8.6 TEB: 10.29 گرم تریس، 0.6 گرم EDTA، 3.2 گرم اسید بوریک را وزن کرده و آب مقطر را به 1000 میلی لیتر اضافه کنید.

(2) بافر بورات: 6.87 گرم بوراکس و 5.56 گرم اسید بوریک وزن کنید و آب مقطر را به 1000 میلی لیتر اضافه کنید.

رویه:

Pترمیم محلول هموگلوبین

3 میلی لیتر خون حاوی هپارین یا سیترات سدیم را به عنوان ضد انعقاد مصرف کنید. 10 دقیقه با دور 2000 سانتریفیوژ کرده و پلاسما را دور بریزید. گلبول های قرمز را سه بار با سالین فیزیولوژیک (750 دور در دقیقه، هر بار 5 دقیقه سانتریفیوژ) بشویید. به مدت 10 دقیقه با دور 2200 سانتریفیوژ کرده و مایع رویی را دور بریزید. به مقدار مساوی آب مقطر اضافه کنید، سپس 0.5 برابر حجم تتراکلرید کربن اضافه کنید. به مدت 5 دقیقه به شدت تکان دهید و سپس با سرعت 2200 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ کنید تا محلول Hb بالایی برای استفاده بعدی جمع آوری شود.

خیساندن غشا

غشای استات سلولز را به نوارهایی به ابعاد 3 × 8 سانتی متر برش دهید. آنها را در بافر PH 8.6 TEB خیس کنید تا کاملاً اشباع شوند، سپس خارج کرده و با کاغذ صافی خشک کنید.

لکه بینی

با استفاده از یک پیپت، 10 میکرولیتر از محلول هموگلوبین را به صورت عمودی بر روی غشای استات سلولز (سمت ناهموار)، در حدود 1.5 سانتی متر از لبه قرار دهید.

الکتروفورز

محلول بافر بورات را در محفظه الکتروفورز بریزید. غشای استات سلولز را با قسمت خالدار در انتهای کاتد محفظه قرار دهید. با ولتاژ 200 ولت به مدت 30 دقیقه کار کنید.

شستشو

نواحی HbA و HbA2 را جدا کنید، آنها را در لوله های آزمایش جداگانه قرار دهید و به ترتیب 15 میلی لیتر و 3 میلی لیتر آب مقطر اضافه کنید. به آرامی تکان دهید تا هموگلوبین کاملاً شسته شود، سپس مخلوط کنید.

رنگ سنجی

جذب را با استفاده از آب مقطر برای محلول شستشو صفر کنید و جذب را در 415 نانومتر اندازه گیری کنید.

محاسبه

HbA2(%) = جذب لوله HbA2 / (جذب لوله HbA × 5 + جذب لوله HbA2) × 100%

محاسبه نتایج تجربی

محدوده مرجع برای pH 8.6 TEB بافر الکتروفورز سلولز استات: HbA > 95٪، HbA2 1٪ - 3.1٪

یادداشت ها

زمان الکتروفورز نباید خیلی طولانی باشد. غشای استات سلولز نباید در طول الکتروفورز خشک شود. هنگامی که HbA و HbA2 به وضوح از هم جدا شدند، الکتروفورز را متوقف کنید. الکتروفورز طولانی مدت می تواند باعث انتشار باند و تاری شود.

از استفاده بیش از حد نمونه خودداری کنید. مایع هموگلوبین بیش از حد می تواند منجر به جدا شدن نوار یا رنگ آمیزی ناکافی شود و در نتیجه سطح HbA به طور کاذب افزایش یابد.

جلوگیری از آلودگی غشای استات سلولز با پروتئین.

جریان نباید خیلی زیاد باشد. در غیر این صورت، نوارهای هموگلوبین ممکن است از هم جدا نشوند.

همیشه نمونه‌هایی از افراد عادی و هموگلوبین‌های غیرطبیعی شناخته شده ضروری را به‌عنوان شاهد در نظر بگیرید.

Beijing Liuyi Biotechnology مخزن الکتروفورز حرفه ای را برای الکتروفورز هموگلوبین تولید می کند که مدل آن است.DYCP-38Cمخزن الکتروفورز غشایی سلولز استات، و دو مدل منبع تغذیه الکتروفورز برای مخزن الکتروفورز غشای سلولز استات موجود است.DYY-2CوDYY-6Cمنبع تغذیه

در همین حال، بیوتکنولوژی Beijing Liuyi غشای استات سلولز را برای مشتریان فراهم می کند و اندازه غشای استات سلولز را می توان سفارشی کرد. خوش آمدید به درخواست نمونه و اطلاعات بیشتر از ما.

برند Beijing Liuyi بیش از 50 سال سابقه در چین دارد و این شرکت می تواند محصولات پایدار و باکیفیت را در سراسر جهان ارائه دهد. از طریق سالها توسعه، شایسته انتخاب شماست!

ما اکنون به دنبال شرکای هستیم، هم مخزن الکتروفورز OEM و هم توزیع کنندگان مورد استقبال قرار می گیرند.

اگر برنامه ای برای خرید محصولات ما دارید، لطفا با ما تماس بگیرید. می توانید به ایمیل ما پیام ارسال کنید[ایمیل محافظت شده]یا[ایمیل محافظت شده]، یا لطفا با ما تماس بگیرید +86 15810650221 یا واتساپ +86 15810650221 را اضافه کنید یا وی چت: 15810650221